2025/11/21
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生物土壤结皮监测
生物土壤结皮是一类由细菌、真菌、蓝绿藻、地衣及苔藓等隐花植物及其分泌物与地表土壤相互凝结形成的复合体，主要分为藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮3类。作为草地和荒漠地表重要地被类型，生物土壤结皮广泛分布于全球干旱和半干旱区，对草地和荒漠地表稳定、水文过程、养分循环和植被演替等过程均具有重要作用，是草地、荒漠地-气界面的“开关”。准确监测生物土壤结皮的多样性、盖度及其变化趋势对生态系统稳定性的评估具有重要价值。因此，在草地和荒漠植物多样性监测中，建议开展生物土壤结皮监测。
1样地的选择
1.1生物土壤结皮类型的划分
根据生物土壤结皮优势类群，将其划分为藻结皮（藻类为主）、地衣结皮（地衣为主）、苔藓结皮（苔藓为主）、藻类−地衣混生结皮（藻类和地衣共同为主）、藻类−苔藓混生结皮（藻类和苔藓共同为主）、地衣−苔藓混生结皮（地衣和苔藓共同为主）及藻类−地衣−苔藓混生结皮（藻类、地衣和苔藓盖度基本一致）。进一步可以结合某一种结皮类型内物种的丰富度对结皮类型进行细分，比如以具鞘微鞘藻为主的藻结皮、以齿肋赤藓为主的苔藓结皮、以银叶真藓为主的苔藓结皮等。
1.2样地选择
针对每种结皮类型的特点，选择地形相对平坦，优势结皮类型发育良好且分布均匀的区域进行样地建设。乔、灌木的存在会影响地表光照强度、温度及土壤养分、水分等环境，将显著影响生物土壤结皮的发育，并在生物土壤结皮盖度调查时影响盖度的准确估算。因此，在设置样方时，应尽可能避开乔、灌木大面积存在的区域。
样方大小设置为20 m × 20 m，样地布局同草本植物群落监测样地一致，在样地中心设置10 m × 10 m 核心区，核心区外为缓冲区（图1）。其中，核心区主要用于非破坏性的调查，缓冲区主要用于轻度破坏性调查。
1.3样方设置
首先，确定样地中心点，记录样地中心点的经纬度坐标，以此为参照点，用罗盘和卷尺找出东、西、南、北4个方向，分别标记出4个方向的方向线（图1）；然后，在4个方向上以距中心点的距离为5 m和10 m的位置为核心区和缓冲区外边界的中间点，垂直于方向线确定核心区和边缘区的边界；最后，将样地中心点和4个边界的中间点用长度50 cm的钢筋界桩标记，钢筋界桩露出地表0.5 cm，并记录地理坐标参数。
1.4调查样方设置
由于生物土壤结皮空间异质性较大，因此采用样线法对生物土壤结皮的盖度进行调查。在核心区调查时依次沿中心边（Q0）、北边（Q1）和南边（Q2）自东向西设置1 m×1 m的样方，每条边设置10个样方，自东向西依次为1−10号，这样沿中心边（Q0−1, Q0−2, Q0−3······Q0−10）、北边（Q1−1, Q1−2, Q1−3······Q1−10）和南边（Q2−1, Q2−2, Q2−3······Q2−10）共设置30个样方（图1）。
同时对缓冲区的中心边（Q3）、东边（Q4）和西边（Q5）自北向南设置1 m×1 m的样方，每条边20个样方，自北向南依次为1−20号，这样沿中心边（Q3−1, Q3−2, Q3−3······Q3−20）、北边（Q4−1, Q4−2, Q4−3······Q4−20）和南边（Q5−1, Q5−2, Q5−3······Q5−20）共设置60个样方（图1）。
1.5样地信息采集
建好样地后，首先将样地中心点地理坐标、4个方向线与核心区边界和缓冲区外边界交会点的地理坐标详细记录。同时，记录样地海拔、坡位、坡向、坡度、土壤类型、植被类型、干扰类型及受干扰程度等。
图1 样方设置示意图
2调查指标和方法
2.1调查时间
由于草本植物的生长会对生物土壤结皮的调查产生较大的影响，因此，生物土壤结皮的调查尽可能选择在秋季草本植物枯萎30天后进行，或春季植物萌发前进行。
2.2调查指标
（1）生物土壤结皮特征：不同类型生物土壤结皮的丰富度、生物量、盖度、硬度、粘结力、养分特征等参数；对于苔藓结皮，记录苔藓种类和各种类苔藓结皮的盖度。
（2）植物群落特征：针对乔灌木和草本植物的监测指标及监测方法按照前章介绍的监测指标和监测方法执行。
（3）环境特征：土壤理化性质、土壤酶活性、土壤微生物多样性等指标。
2.3调查方法
本节首先叙述所有结皮类型都需要调查的指标且调查方法一致部分。对于不同结皮类型的特殊调查指标和调查方法，按照不同生物土壤结皮类型来进行分类描述。
（1）盖度
在每个标定的1 m × 1 m样方内（共90个），利用高清相机进行垂直拍照，拍照时用太阳伞阻挡阳光，避免因太阳角度造成局部阴影和强光导致的局部过度曝光。将拍摄的照片采用“监督分类法”对生物土壤结皮的盖度进行估算。由于藓类植物和藻类植物在遇水后会在1 min内变绿，为便于统计，可在拍照之前，先用小喷壶将结皮表层喷湿。
（2）生物量
统一用环刀（内径70 mm，高度52 mm）扣取不同类型生物土壤结皮，将生物结皮与下层土壤自然剥离，将上层生物结皮样品装入密封袋中带回。
苔藓结皮生物量：将风干后避光保存的苔藓结皮用水喷湿，使其脱离休眠状态，将苔藓结皮样品放入网筛中冲洗，收集网筛中苔藓植物后，放至称量瓶中，于85℃的烘箱中杀青30分钟，然后，在65 ℃下将苔藓植物烘干至恒重后称重，最后，计算出单位面积苔藓生物量（g·dm-2）。
藻结皮和地衣结皮生物量：采用叶绿素含量表示，叶绿素含量采用乙醇法对其进行测定（Castle et al., 2011）。分别称取1.00 g的藻类和地衣结皮鲜样，加入10 ml 95%的无水乙醇充分研磨后，暗反应24 h后4 ℃离心30 min，随后在649 nm、665 nm下测定吸光度值，根据以下公示计算叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)，总叶绿素含量：
Chla(mg·L-1)=13.95×A665-6.88×A649
Chlb(mg·L-1)=24.96×A649-7.32×A665
X = C×V×N ∕ M
式中，X为色素含量(mg·g-1)，C为色素浓度(mg·L-1)，V为提取液体积(L)，N为稀释倍数, M为样品质量(g)。
（3）硬度
用硬度计对不同类型生物土壤结皮硬度进行测定，每种结皮类型测定不低于20个重复，去除极大值和极小值后求平均值。
（5）黏结力
用土壤剪切仪测定不同类型生物土壤结皮的粘结力，每种结皮类型测定不低于20个重复，去除极大值和极小值后求平均值。
（5）养分特征
①生物土壤结皮样品采集
a生物土壤结皮层样品采集：不同的生物土壤结皮其结皮层厚度不同，因此，根据优势生物类群组成可将结皮土壤样品分为藻结皮样品、地衣结皮样品以及苔藓结皮样品。
b藻结皮样品采集：由于藻结皮较薄，通常只有1 mm厚。因此，使用轻薄刀片进行样品采集。采样时，将刀片紧贴地面，沿地面将地面表层藻结皮翘起，自然剥离的一层。
c地衣结皮样品采集：地衣结皮厚度约为5 mm左右，采用类似藻结皮采集方法，使用轻薄刀片，将刀片紧贴地面，沿地面将地面表层地衣结皮翘起，自然剥离的一层。需要注意的是地衣结皮容易在土壤表面形成凸起，在取样时尽量避开，或沿土壤表面凹凸程度调整刀片的方向，保证地衣结皮厚度基本不变，将其作为地衣结皮样品。
d苔藓结皮样品的采集：苔藓结皮层较厚，约为20 mm，在采集苔藓结皮样品时，使用镊子铲，将镊子铲垂直插入土壤20 mm左右，然后调整镊子铲至水平方向，自然剥离苔藓结皮层。
每个样地选取5个取样点采集生物土壤结皮层样品。
②生物土壤结皮养分特征
生物土壤结皮能够固定碳和氮，同时，氮和磷养分含量能够直接影响植物的光合作用，进而影响结皮的生长。在结皮演替中，氮、磷含量能够显著影响生物土壤结皮生长发育，藻结皮、地衣结皮及苔藓结皮自身养分特征也能够反映生物土壤结皮对环境的适应能力、受到土壤环境的影响强度。统一测定监测样地生物土壤养分的特征，可为其分布区的管理和未来生物土壤结皮的生长和发育预测提供科学依据。
a藻结皮、地衣结皮养分含量测定：均以结皮层土壤为研究对象，测定结皮层土壤的全碳、全氮、全磷含量。藻结皮和地衣结皮生物量一般与可进行光合作用的生物量成正比，因此可用结皮层叶绿素a含量进行计算。
b苔藓结皮层中苔藓植物的养分含量测定：与藻类和地衣结皮不同，苔藓结皮由苔藓植物与土壤颗粒凝结构成，在分析苔藓结皮养分特征时通常分为苔藓植物和土壤两部分，其中苔藓植物采取过筛和清洗、烘干获取苔藓植物样品，磨碎后测定植物养分特征；将结皮层过晒后的土壤用于结皮层土壤养分的测定。
藻结皮、地衣结皮和苔藓植物均需要测定其全碳、全氮、全磷含量，测定方法如下。
a全碳含量测定：全碳的测定一般用干烧法测定，主要利用TOC碳氮分析仪进行干烧法测定。具体步骤可参照吴冬秀等（2019）编写的《陆地生态系统生物观测指标与规范》。
b全氮含量测定：使用凯氏定氮法进行全氮含量的测定。具体步骤可参照吴冬秀等（2019）编写的《陆地生态系统生物观测指标与规范》。
c全磷含量测定：使用钼锑抗比色法测定全磷含量。具体步骤可参照吴冬秀等（2019）编写的《陆地生态系统生物观测指标与规范》。
3土壤环境数据采集
土壤环境主要包括土壤理化性质和土壤酶活性。生物土壤结皮主要通过影响土壤理化性质和土壤酶活性来影响土壤肥力和土壤质量。土壤环境影响生物土壤结皮的生长和发育，主要表现为土壤的稳定有助于藻结皮的定植，有机碳的积累有助于藻结皮向地衣结皮的演替，氮、磷养分含量提升有助于地衣结皮向苔藓结皮演替。生物土壤结皮可能较植物对土壤酶活性和养分含量更加敏感。因此，土壤理化性质和土壤酶活性在评价生物土壤结皮生长及其功能过程中具有重要作用。
3.1土壤采集方法
目前，国内外对生物土壤结皮土壤环境样品的采集无统一规定，土壤样品的采集大多根据研究目的进行人为的划分，造成诸多研究之间的可比性较低。为了方便进行不同区域生物土壤结皮中土壤理化性质和土壤酶活性的比较，现将生物土壤结皮土壤环境样品采集方法进行统一，以期提升数据的可比性和通用性，有助于进行不同区域之间生物土壤结皮土壤环境间的对比，进一步揭示不同区域土壤环境与生物土壤结皮生长和演替间的关系，为未来对生物土壤结皮系统性研究提供标准化的研究方法。
结皮下层土壤样品采集：在收集结皮层土壤样品后，在结皮下层土壤一侧挖5 cm深的刨面，使用直尺测量从结皮下层土壤表面至结皮下层土壤2 cm、5 cm深度，进行标记，使用镊子铲采集结皮下层表面到2 cm深度标记处的土壤约100 g作为结皮下层土壤0~2 cm土壤样品；随后使用镊子铲收集2 cm深度标记处到5 cm深度标记处的结皮下层土壤，收集约100 g土壤样品，作为结皮下层2~5 cm结皮下层土壤样品。
土壤环境样品采集：在监测样地外进行土壤样品采集，选取一个地势平缓且能够表征该样地土壤状况的地方，在采样点旁边挖100 cm深的土壤剖面，在土壤剖面使用钢卷尺测量不同土层深度，为了和生物土壤结皮下层土壤分层保持一致，从土壤表面分别量取2 cm、5 cm、10 cm、20 cm、40 cm、60 cm、80 cm、100 cm进行标记，随后使用镊子铲按照土壤深度的标记顺序依次进行分层取样收集0~2 cm、2~5 cm、5~10 cm、10~20 cm、20~40 cm、40~60 cm、60~80 cm、80~100 cm的土壤样品约100 g，进行标记后带回实验室。
3.2土壤理化性质和土壤酶测定
本规范主要测定结皮层、结皮下层土壤及监测样地土壤理化性质和土壤酶活性。由于藻结皮和地衣结皮与土壤难以分开，因此，将藻结皮和地衣结皮层土壤直接测得的土壤养分含量作为藻结皮和地衣结皮层土壤养分含量。苔藓结皮中结皮层土壤可以用土壤筛将苔藓植物和结皮层土壤进行分离，将分离过筛后的苔藓结皮层土壤进行养分含量测定，测定后可获得苔藓结皮层土壤养分含量。
土壤理化性质的测定指标主要包括：土壤有机碳、全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾、八大离子含量以及土壤pH值和电导率。理化分析具体方法可参考潘贤章等（2019）编写的《陆地生态系统土壤观测指标与规范》。
根据参与过程不同，可以将土壤酶分为与碳循环相关的土壤酶、氮循环相关土壤酶活性以及与土壤磷循环相关的土壤酶。参与土壤碳、氮、磷循环相关的酶主要包括土壤-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶、脲酶、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶。其中土壤-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶是土壤酶化学计量的重要指标，且是参与土壤碳、氮、磷养分循环的重要酶活性来源，因此，主要测定此4种酶活性。具体测定方法可参考关松荫（1986）编写的《土壤酶及其研究法》。
4生物土壤结皮微生物群落分析
4.1样品采集和分析测试
在缓冲区样方采集土壤样品，各样方以梅花方式取0~5 cm土壤样品进行混合，以典型生物土壤结皮演替类型，如裸沙、藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮等标记土壤样品生物结皮类型。去除落叶、残根、石子等杂物过2 mm筛子，于−80 ℃下冷冻保存用于土壤样品DNA提取。按照理化性质测定要求，测定样点土壤含水量、pH、温度及有机碳和碳氮比等环境参数。微生物生物量用微生物碳估计，采用氯仿熏蒸提取-紫外比色法测定，每个混合样品设置3个重复。氯仿熏蒸提取−紫外比色法具体步骤可参照吴冬秀等（2019）编写的《陆地生态系统生物观测指标与规范》。
4.2微生物丰度测量
基于细菌16S rRNA基因通用引物Eub341F/Eub534R和真菌ITS基因通用引物ITS1F/ITS4进行实时定量聚合酶链式反应（qPCR），用目的基因重组质粒制备标准曲线，由Ct值确定初始模板浓度，计算各样品细菌基因拷贝数。每个土壤样品微生物绝对丰度测量重复3次。
4.3微生物群落结构解析
采用16S rRNA和ITS基因高通量测序技术分析细菌和真菌的群落结构及多样性。高通量测序建议采用Illumina Hiseq测序平台，16S rRNA基因测序区间为V3−V4区（515F/806R），ITS基因测序区间为rRNA基因内转录间隔区（ITS4/gITS7F）。混合三次扩增产物，建立文库，使用Hiseq平台PE250双末端测序；以97%序列相似度定义操作分类单元（OTUs）；数据生物信息学分析主要包括OUTs聚类分析、丰度分析、α多样性、β多样性和环境相关性分析等。
5土壤结皮数据档案建立
将以上获得的生物土壤结皮调查数据、样地环境数据、植物群落数据及影像资料统一汇总备份，建立生物土壤结皮模式样地信息档案。信息档案主要分为两大项，包括生物土壤结皮信息（生物土壤结皮类型、物种组成、环境数据等）和植物群落信息（群落地理位置、环境信息、群落照片、群落季相特点）。建成的信息档案明确标注档案建立人、建立日期等详细内容，以便于后期分析利用。