调查和监测方法

1 大型真菌调查和监测方法

大型真菌泛指所有能够形成肉眼可见的子实体的真菌，在土壤、倒木、活木、落叶层等基质上着生。调查方法主要有样带法、样方法和踏查法等，根据调查的大型真菌种类和调查地点的不同，可以选择一种方法或多种方法混合的策略来对大型真菌进行调查。选择受人为干扰小且容易到达的地点进行调查。

1.1 大型真菌调查方法

（1）样带法  在调查地点建立贯穿于某个或几个植物群落引出标准线，再沿着此线设一定的带状调查区进行调查；样带要涵盖调查地点的所有植被生态类型，而且在每个植被类型中至少建立3条重复样带，每条样带20~50 m宽、500~1000 m长，样带间至少保持50 m的间隔距离。根据调查地点的生境情况建立样带，例如在山地森林生态系统中，由于不同海拔高度或不同坡向的生物群落存在较大差异，因此为了更加全面了解调查地点的大型真菌多样性，一方面可以沿着从山底到山顶的方向建立样带，每个样带包括了调查地点的所有植被类型；另一方面可以分别在不同海拔梯度上建立样带，每个样带包括一个植被类型。

（2）样方法  在调查地点建立固定大小的样方，或者依托现有的生物多样性监测网络已建的大型固定样地。例如，在森林生态系统中建立的大型固定样地（15~60 hm²）中都建立了20 m × 20 m样方，为了比较全面调查该地点的大型真菌多样性，在每个大样地选择100个样方，样方应均匀分布于大样地，覆盖所有的植被类型、地形等生境。

（3）踏查法  在调查地区选择有代表性的区域设立调查路线，包括不同地形地貌、海拔、植被类型等生境。例如，在山地森林生态系统中，可以沿着人行道设立调查路线，或者沿着山脊和山谷设立调查路线。

1.2大型真菌标本采集与处理

在调查区域采集真菌的子实体，用采集刀等工具完整挖取子实体，记录子实体的着生方式（地生、活木、死木、凋落物等）、颜色、是否受伤变色、大小等宏观特征，拍摄采集地点现场生境照片、子实体野外照片，并记录采集日期、地点、海拔、经纬度、采集人等信息（表1）。

表1 大型真菌采样信息表

使用便携式烘干箱在30~35℃温度下及时烘干采集的标本，含水量较多或者体积较大的标本需要剖开或切取3~5个切片，放入做好标记的纸质采集袋内烘干，带回实验室用于形态和分子物种鉴定，切成薄片后间歇性烘烤才能完全干燥。烘干的标本装入纸质采集袋，编号，在-40℃以下的冰柜中冷冻杀虫卵一周以上后，保存在标本馆等适宜场所。烘干的标本脆，受到挤压后很容易碎，所以，运输过程避免挤压。如果不方便采集当天烘干，应将标本置于采集袋内，保持通风，尽快运回实验室。

对于采集的新鲜标本可以进行分离菌种，在酒精灯下用灭菌手术刀切开表面消毒的子实体（75%乙醇），用灭菌的接种针挑取少量子实层组织，放入提前准备好的含有PDA等固体培养基的试管中，做好标记，放在室内进行培养。

1.3 大型真菌的形态和分子鉴定

1.3.1形态鉴定

包括宏观和微观形态特征观察。

子实体（担子果、子囊果）的宏观特征如大小、形状、颜色、质地、气味等，单年生、多年生，平伏、盖状无柄或具柄，单生、连生、群生或覆瓦状叠生，菌盖表面的颜色、光滑或粗糙、具绒毛或粗毛、有无环带或纵纹、边缘钝或锐、薄或厚等，子实层的类型、形状、颜色、每毫米孔或褶或刺等的个数，纵切面特征如皮层或绒毛厚度，与菌肉有无细线分隔等。

以Melzer、棉蓝和50 g/L KOH溶液等试剂作为切片浮载剂，在显微镜下观察显微性状，包括：菌丝系统是单系、二系、三系，菌丝在棉蓝试剂中有无嗜蓝反应，在Melzer试剂中有无淀粉质反应或拟糊精反应，在50 g/L KOH溶液中有无变化或反应；菌髓或菌肉菌丝的排列方式，生殖菌丝的颜色、分隔或锁状联合、壁厚、平直或弯曲、有无分枝、常见或稀少，骨架菌丝的颜色、壁厚、平直或弯曲、有无分枝、致密或疏松交织排列或平行排列、直径，囊状体或拟囊状体的有或无、形状、壁厚、是否包被结晶、大小，其他结构如刚毛、树状菌丝或菌丝钉等的有无，担子、拟担子、子囊形状、担孢子梗数量、大小，担孢子和子囊孢子的大小、形状、颜色、表面光滑或有纹饰，在棉蓝试剂和Melzer试剂中的反应。在Melzer试剂中如果变黑色称之为淀粉质反应，如果变黄褐色称之为拟糊精反应，如果不变色称为负反应；在棉蓝试剂中如果变蓝色称为嗜蓝反应，不变色称为负反应。

1.3.2分子生物学鉴定

步骤包括用CTAB法提取大型真菌DNA、PCR扩增、序列测定与分析。

（1）用CTAB法提取大型真菌DNA  即取烘干标本的子实层0.25 g，加入适量灭菌石英砂和液氮，在研钵中研磨成粉末，将粉末转入离心管，加入适量提取液CTAB（W/V，2%）混合均匀，60℃水浴30~60 min后，加入600 μL的24:1的氯仿：异戊醇，混合均匀后12000 g离心15 min，吸出上清液（约500 μL），加入等体积的预冷24:1的氯仿：异戊醇溶液，4℃，12000 g离心15 min，吸出上清液（约300 μL），加入预冷的5 mol/L 乙酸钾约30 μL（1/10体积），然后加入预冷异丙醇约200 μL（2/3体积），轻轻上下摇动离心管混匀，于-20℃下过夜沉淀后，于4℃，9200 g离心2 min，弃掉液相，加入400 μL预冷的70%乙醇，振荡洗涤，再次4℃，9200 g离心2 min，弃掉液相，重复两次，将样品置于干燥机中，室温下抽真空干燥DNA，约15 min，加入50 μL无菌去离子水或无菌TE缓冲液，室温下充分溶解DNA样品后于-20℃下保存用于PCR扩增。

（2）PCR扩增  大型真菌rDNA的转录间隔区（ITS）、大亚基（LSU）、小亚基（SSU）等基因片段，PCR反应体系（25 μL）包括无菌去离子水7 μL、10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Plus）5 μL、dNTP Mixture 8 μL、TaKaRa LA Taq酶0.5 μL、正向和反向引物（根据扩增的目的DNA片段选择，表2）各1 μL、DNA模板2.5 μL。PCR反应条件为首先进行模板DNA预变性（95℃、3 min），然后进行30~35个变性（94℃、30 s）、退火（52~56℃、30 s）、延伸（72℃、30~60 s）循环，最后在72℃下维持2 min。PCR产物在琼脂凝胶（W/V，1%）上进行电泳检查，并使用PCR产物纯化试剂盒（Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA）纯化PCR产物，

（3）序列测定与分析   PCR产物进行双端测序（ABI 3730 XL）。将获得的高质量DNA序列在公共序列数据库（GenBank、UNITE）中用BlastN进行搜索，以获得相似的DNA序列及分类学信息，下载相关的可靠序列，运用ClustalX软件对DNA序列进行比对（alignment），运用PAUP进行最大简约法构建系统发育树，确定真菌的系统演化位置，最终结合形态学和DNA序列分析进行物种鉴定。

表2 真菌常用基因片段扩增的引物

2 土壤微生物群落多样性调查和监测方法

2.1 野外土壤样品采集方法

在调查地点选择的样带或样方内采集土壤样品，除去土壤表面的凋落物，利用土钻取土壤样品（15 cm深、直径2~5 cm），根据样方大小决定采集土壤样品的数量，如在20 m × 20 m样方的核心区（距离四周边线5 m内）均匀采集9份土壤样品（样品间距约5 m）混合成1份样品，将样品过筛（2 mm孔径）除去根系、石块等，装入无菌自封袋或布袋，冷冻处理（-20℃冰箱或干冰），在冷链条件下用冰盒运回实验室，微生物检测样本需要尽快进行实验室检测步骤，以防止微生物组成发生改变。土壤如需长期保存，则放入-20℃或-80℃冰箱保存，避免反复冻融。-20℃冰箱无法保证微生物长期稳定存在。如具备冷冻干燥条件，可将土壤置于50 mL无菌离心管进行冻干处理，获得的冻干粉可置于4℃或-20℃长期保存，可相对延长微生物组成的稳定性。

通常每份新鲜土壤样品重量约500 g。样品采集完毕，在自封袋或布袋上完整标记样本信息、日期、采集人。另外，一个采样点内通常需要多个生物学重复（n ≥ 20）和技术重复。生物学重复代表该样点的独立个体样本，一个生物学重复样品由多个技术重复混合而来，如上述的一个样方内采集的9份土壤样品。生物学重复之间需要相隔一定距离（一般情况> 20 m），以保持重复样品的独立性。

2.2 DNA提取、PCR、高通量测序

2.2.1 DNA提取

野外采集的土壤样品冷藏运回实验室，立即用鲜土或冷冻干燥后进行DNA的提取。有机质含量高的土壤、复杂的土壤等，推荐采用强力土壤DNA提取试剂盒（QIAGEN DNeasy PowerSoil Kit）对样本的基因组DNA进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop检测DNA的纯度和浓度，浓度大于10 ng/µL，OD260/280值和OD260/230值在1.8左右，表示质量较好。一般的环境样品提取的DNA可以在-40°C或-80°C冰箱中保存1~5年，DNA冷冻干燥后保存时间可更长久。取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品浓度至10 ng/μL，用于后续PCR扩增实验。

2.2.2 PCR扩增

以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带条形码（barcode）的特异引物和高效高保真的酶（表1-3）进行PCR扩增，确保扩增效率和准确性。一个样品对应一个独特的标签，标签是一段含有8~12个碱基的DNA片段，用来区分不同的样品，如在细菌引物合成时加在515F引物的5’端，真菌引物合成时加在fITS7引物的5’端，原生生物引物合成时加在EukBr引物的5’端。PCR反应体系（25 μL）包括无菌去离子水14 μL、10 × PCR Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture（2 mmol/L）2.5 μL、Mg²⁺（25 mmol/L）1.5 μL、高保真酶0.5 μL、正向和反向引物各0.75 μL、DNA模板2.5 μL。引物的选取，根据扩增的目的DNA片段选择，细菌推荐使用515F/806R引物扩增16S rRNA基因，原生生物推荐使用Euk_1391f和EukBr引物扩增18S rRNA基因，真菌推荐使用fITS7和ITS4引物扩增ITS2片段，引物的序列见表1-2。PCR反应条件为首先进行模板DNA预变性（95℃、3 min），然后进行30~35个变性（95℃、30 s）、退火（真菌58℃、细菌56℃、原生生物57℃、30~45 s）、延伸（68℃、30 s）循环，最后在68℃下维持5 min。环境样品中抑制剂含量高，可以通过稀释样品、提高MgCl₂含量、提高Taq酶用量、加牛血清蛋白（BSA）来解决。通常细菌16S rRNA比真菌ITS容易扩增，更比18S rRNA容易扩增。PCR扩增实验要特别注意避免污染的问题，可通过设置阴性对照来检验。由于土壤病毒基因组的高度变异性和杂合性，目前，尚未设计出通用引物，只存在针对某些特定病毒家族的简并性引物，如针对T4型噬菌体的g23标记基因（Adriaenssens & Cowan, 2014）。此外，可利用随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）方法对未知序列基因组进行多态性分析（Williams et al., 1990）。

2.2.3 PCR产物纯化和定量

PCR产物使用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，对目的条带使用普通胶回收试剂盒回收产物（如Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit），并用Nanodrop、Qubit或Picogreen方法进行浓度测定和质量检测。PCR胶回收产物浓度和质量要求：浓度大于10 ng μL^-1，OD260/280值在1.8左右，OD260/230值最好≥1。根据PCR回收产物浓度进行等摩尔量混合，每一个混合样品中不能有相同的标签。

2.2.4 文库构建和上机测序

主要由测序公司完成。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建。文库构建的目的是：①不同混合样品加上不同的index，以区分不同的文库，同一个文库中不能有重复的barcode样品；②把adaptor连接到PCR产物分子上，使被测序的分子连接到测序芯片上的Oligo点阵上。构建好的文库经过Qubit和qPCR定量，文库合格后，使用Illumina的Miseq/Hiseq/Novaseq或PacBio的Sequel测序平台上机测序。

2.3 生物信息学分析

建议主要使用QIIME 2对原始序列进行处理。利用q2-cutadapt插件去除引物和标签序列，利用DADA2插件进行序列降噪，嵌合体、冗余和单一序列的去除，具体流程建议如下：

（1）准备符合QIIME 2输入格式的样品清单文件manifest.tsv（包含样品ID以及序列文件路径，双端原始序列需要标明引物正反向）。

（2）使用FLASH软件（V1.2.11）对每个样品的序列进行配对拼接，得到单端拼接原始序列，将单端拼接原始序列fastq文件转换成符合QIIME 2输入格式的qza文件，或者直接输入双端原始序列。

（3）使用quality-filter整体过滤q-score小于25的序列。

（4）使用summarize插件查看低质量碱基的位置分布，设置过滤参数，首先根据PCR扩增产物的长度，先将所有序列截取到一定长度（如针对515F-806R引物对，截取到250 bp），然后再根据barcode和引物的长度，去除序列5’前的barcode和引物序列以防止对后期注释准确度的影响，使用DADA2进行序列进一步过滤、去重复、嵌合体去除，生成ASVs或OTUs丰度表和代表序列；

（5）使用VSEARCH 2.18.0软件的Sintax命令，以0.65的阈值标准对细菌、真菌或原生生物ASVs或OTUs进行分类地位的鉴定，获得土壤微生物多样性数据，细菌参考Silva数据库，真菌参考UNITE（+INDSC）数据库，原生生物参考PR2数据库，丛枝菌根真菌参考MaarjAM数据库，病毒g23建议将获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列后，在NCBI数据库中进行BLASTp比对。

3 土壤微生物宏基因组多样性监测方法

3.1野外土壤样品采集方法

土壤基因组多样性监测的野外取样方法，与前述2.1相同。

3.2 DNA提取、测序

提取DNA方法与2.2.1相同，提取后检测其浓度和纯度。宏基因组测序最低DNA的量每个样品至少达到0.5 μg，浓度≥50 ng/μL，DNA无降解，无RNA和蛋白质等杂质污染。对于土壤宏病毒组的研究具有一定难度，原因在于土壤病毒虽然数量很多，但其基因组非常小，病毒基因组占土壤微生物基因组很小的一部分，所以采用无差别的针对土壤基因组的宏基因测序技术，则病毒的基因信息会被掩盖。所以土壤病毒宏基因组的测序前提是确保获得的病毒遗传物质不含寄主遗传物质的污染，OD260/280 为 1.8~2.0，OD260/230 ≥ 1.0。

测序步骤主要包括：①基因组DNA样品用物理方法（如超声破碎）随机打断成小片段；②小片段DNA末端碱基修复，3’端加A碱基，加测序接头（adaptor）；③DNA片段经琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR富集形成测序文库；④文库纯化和去接头污染；⑤质量检测合格的样品上机测序。

3.3 生物信息学分析

土壤宏基因组数据处理流程主要包括如下4个步骤：短测序reads拼接为更长的contigs；Contigs的ORF预测；非冗余基因集的构建及基因丰度估计；物种和功能注释。

（1）Contigs拼接  使用FastQC软件对测序获得的fastq序列文件进行质量和序列检测，根据Q₂₀、Q₃₀、Adaptor序列检测结果判断是否需要进一步质控与修剪。如有需要可利用trimmomatic软件去除低质量序列，并修剪掉测序的adaptor，得到高质量的序列。

宏基因组序列的拼接可以利用Megahit、IBDA-UD、SPAdes等软件进行。也可以比较2~3个软件的拼接效果，选择较好的进行下一步操作。具体操作参看相应的操作说明书进行。拼接完的序列可以利用QUAST软件评估其质量。

（2）Contigs的ORF预测  ORF的预测可以利用MetaGene、Prodigal进行。MetaGene输出结果为一个单一文件，包含ORF在contigs上的起始位置，正负链，是基于数据库预测还是密码子直接预测等信息。Prodigal预测结果文件结果较全面，包括ORF的核酸序列文件、氨基酸序列文件、gff文件等，需要注意的是用于宏基因组ORF预测时需要选择meta模式。

（3）构建非冗余基因集及基因丰度估计  使用CD-HIT（Li & Godzik, 2006）软件构建非冗余基因集。进行聚类（聚类相似度≥0.95，覆盖度≥0.9），每个类取最长的ORF序列作为代表序列，构建非冗余基因序列集合。

将质控后的高质量序列比对到非冗余基因集上，计算每个基因在各样品中的丰度。可利用SOAPAligner或Salmon等软件。SOAPAligner是BGI开发一款快速序列比对软件，适合序列的快速比对。

（4）物种和功能基因注释  物种和基因功能的注释，是将序列比对回数据库，根据序列相似度预测物种和基因功能。目前常用的比对软件是DIAMOND（Buchfink et al., 2015），其对序列的比对速度比BLAST快上万倍，比对结果和BLAST的重复度有80%~90%。对于长序列，需要采取敏感（sensitive）模式，比对速度比BLAST快上千倍，重复度超过90%以上。但DIAMOND只能用氨基酸序列建库。除此以外，物种分析还可以利用MetaPhlAn软件，它可以直接以序列为输入文件，得到物种的丰度信息。

常用的基因注释数据库包括NR、COG、KEGG、CAZy、VFDB、CARD等。如果要分析特定基因，也可以用其他库。其中，CAZy数据库用hmmscan软件进行注释，其他数据库一般用DIAMOND进行注释。注释完成后，可以获得功能基因在样品中的丰度表，从而可以推测样本潜在的功能差异。

4 土壤微生物功能基因多样性监测方法

除了上述宏基因组方法能够监测土壤微生物功能基因多样性之外，高通量基因芯片（GeoChip）也可用于功能基因的检测，用于分析微生物群落，并研究其群落结构对生态系统的功能。

GeoChip芯片包含了编码碳、氮、磷、硫循环、有机污染降解、重金属抗性、抗生素抗性、致病性、植物生长促进、色素和微生物防御、原生生物、电子转运、应急响应、病毒相关、gyrB（系统发育基因）和代谢通路相关的超过84000个基因。该芯片已经成功应用在土壤、水体等环境中。利用GeoChip技术研究主要包括以下步骤：样品采集、核酸提取、核酸检测、荧光标记、芯片杂交和芯片扫描与成像。该芯片可降低宿主基因组对微生物功能检测的影响，灵敏度高，速度快，但对未知基因无法检测。所以，可以结合宏基因组测序和GeoChip技术共同检测土壤功能基因多样性。

5 土壤理化性质分析方法

5.1 土壤总有机碳（TOC）的测定

利用重铬酸钾（K₂Cr₂O₇）氧化法对土壤有机碳（TOC）进行测定。在油浴加热条件下，用过量的K₂Cr₂O₇-H₂SO₄溶液氧化土壤有机碳，多余的K₂Cr₂O₇用硫酸亚铁（FeSO₄）标准溶液滴定，由消耗的K₂Cr₂O₇量按氧化校正系数计算出总有机碳量（TOC）。如在TOC基础上再乘以常数1.724，即为土壤有机质含量。

（1）试剂准备

①浓H₂SO₄。

②K₂Cr₂O₇-H₂SO₄溶液  称取40.0 g K₂Cr₂O₇（分析纯）于烧杯水中，加水溶解，转入1 L量筒，在量筒中加水至1 L。将此溶液移入3 L大烧杯中；另取1 L比重为1.84的浓H₂SO₄，慢慢地倒入K₂Cr₂O₇溶液内，不断搅拌。为避免溶液急剧升温，每加约100 mL浓H₂SO₄后可稍停片刻，并把大烧杯放在盛有冷水的塑料瓶内冷却，等溶液温度降到不烫手时再加另一份浓H₂SO₄，直至全部加完为止。此溶液极易稳定，避光长期保存。冬天溶液易结晶，可放在25℃培养箱中，避光保存。

③0.2 mol/L FeSO₄标准溶液  56.0 g FeSO₄•7H₂O（分析纯）溶解于600~800 mL水中，加浓硫酸15 mL，搅拌均匀，并静置片刻后转移到到1 L量筒中，再用水洗涤滤纸并加水至1 L。此溶液易被空气氧化而致浓度不断下降，故使用时必须每天标定一次准确浓度。该试剂溶液在冬天易形成黄色沉淀，故冬天最好现配现用。每天用之前标定浓度，标定方法：吸取0.2 mol/L K₂Cr₂O₇标准溶液20.00 mL放入100 mL三角瓶中，加3~5 mL浓H₂SO₄和指示剂2~3滴，用FeSO₄溶液滴定，根据FeSO₄溶液的消耗量即可计算FeSO₄溶液的准确浓度。

④0.2 mol/L K₂Cr₂O₇标准溶液  称取经130℃烘2~3 h的K₂Cr₂O₇（基准试剂）9.8061 g，先用400 mL水加热溶解，然后无损失地移入1000 mL容量瓶内，加水定容，避光保存。

⑤邻啡罗啉指示剂  称取分析纯邻啡罗啉1.485 g，七水合硫酸亚铁0.695 g，溶于100 mL水中，贮存于棕色滴瓶中。

（2）操作步骤

称取磨过的土壤0.05~0.5 g土壤于硬质试管，加入10 mL 0.2 mol/L K₂Cr₂O₇溶液，用10 mL移液管贴壁加入，垂直加会使土飞溅，引起误差。油浴（170~180℃）消煮。沸腾计时5~6 min。转入三角瓶，加邻菲罗啉指示剂3滴，用0.2 mol/L FeSO₄ 溶液滴定，邻菲啰啉变色过程经历橙黄 → 蓝绿 → 棕红的过程。记录消耗体积。

每批分析时须同时做2~3个空白标定：取大约0.2 g烧过的浮石粉或土壤代替土样，其他步骤与土样测定时相同，但滴定前的溶液总体积控制在20~25 mL左右为宜。如果滴定待测样品所用FeSO₄溶液的体积不到空白标定所耗FeSO₄溶液体积的1/3，则应减少土壤称样量而重测。

（3）结果计算：

TOC (g·kg^-1) = (V₀ - V) × C × 3 × 1.08 / W

式中，V₀为空白标定时所消耗FeSO₄溶液的体积（mL）；V为土样测定时所消耗FeSO₄溶液的体积（mL）；C为FeSO₄标准溶液的浓度（mol/L）；3为1/4 C原子的摩尔质量（g/mol）；1.08为氧化校正系数（按平均回收率92.6%计算）；W为烘干土样的质量（g）。

5.2 土壤总氮（TN）的测定

H₂SO₄消煮法对土壤总氮（TN）进行测定。样品在浓H₂SO₄溶液中历经脱水碳化、氧化等一系列作用，使有机氮转化为无机NH₄⁺盐。NH₄⁺在强碱性条件下全部变为NH₃，经蒸馏用硼酸（H₃BO₃）液吸收，再用H₂SO₄标准液滴定后，由H₂SO₄标准液的消耗量计算出N的含量。

（1）试剂准备

①浓H₂SO₄。

②硼酸  分析纯。

③10 mol/L NaOH溶液  溶解NaOH 40 g于100 mL无CO₂的去离子水中。

④甲基红-溴甲酚绿混合指示剂  0.099 g溴甲酚绿和0.066 g甲基红溶于100 mL乙醇中。

⑤20 g/L H₃BO₃指示剂溶液  称取20 g H₃BO₃溶于约950 mL水中，加热搅动直至H₃BO₃溶解，冷却后，加入混合指示剂20 mL混匀，并用稀酸或稀碱调节至紫红色（pH约4.8），加水稀释至1 L混匀备用。宜现配。

⑥0.01 mol/L（1/2 H₂SO₄）标准溶液  量取浓H₂SO₄ 2.83 mL，加水稀释至5 L，形成0.02 mol/L（1/2 H₂SO₄），然后用标准碱或H₃BO₃标定。稀释至0.01 mol/L（1/2 H₂SO₄)，形成标准溶液。

⑦混合加速剂  K₂SO₄:CuSO₄:Se = 100:10:1，混合后研磨过80号筛，消煮时每毫升H₂SO₄加0.37 g混合加速剂。

（2）操作步骤

①样品的消煮  称烘干磨细的土壤样品（过0.25~0.5 mm筛）0.1000~0.2000 g，置于消化管中，先用2 mL水全部润湿土壤，再加入1.85 g混合加速剂，然后加浓H₂SO₄ 5 mL，轻轻摇匀（最好放置过夜），在消化炉上先低温加热，待浓硫酸分解冒白烟后逐渐升高温度，将温度控制在380~410℃，待到溶液发绿后再消煮1 h，直到消煮液无色或清亮后开始降温，将消煮液用水定容至100 mL，取过滤液供N元素的测定。每组用石英砂代替土壤做两个空白。

②氨的蒸馏  取过滤后的消煮液10 mL于洗净干燥后的消煮管中，将消煮管放入定氮仪中蒸馏。于250 mL锥形瓶中，加入20 g/L H₃BO₃指示剂混合液5 mL，放在冷凝管末端收集蒸馏液。向消煮管中缓慢加入10 mol/L NaOH溶液20 mL，立即开始蒸馏。蒸馏完毕后，蒸馏液用0.01 mol/L（1/2 H₂SO₄）标准溶液滴定由蓝绿色至刚变为紫红色。记录所用酸标准溶液的体积（mL）。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4 mL。

（3）结果计算

TN计算公式如下：

N (g·kg^-1) = (V - V₀) × C × 14 × ts / W

 式中，V为滴定待测样品时所用酸标准溶液的体积（mL）；V₀为滴定空白时所用酸标准溶液的体积（mL）；C 为1/2 H₂SO₄）标准溶液的浓度（0.01 mol/L）；            14为氮原子的摩尔质量（g/mol）；Ts为消煮液定容的体积 / 所取消煮液用于蒸馏、滴定的体积；W为烘干土样的质量（g）。

5.3 土壤铵态氮（NH₄⁺-N）的测定

新鲜土壤用KCl溶液浸提，浸提液中的NH₄⁺在强碱性介质中与与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，使用比色法测定。NH₄⁺-N含量在0.05 ~0.50 mg/L，吸光度与NH₄⁺-N含量成正比。反应体系的pH应为10.5~11.7。硝普钠是此反应的催化剂，能加速显色，增强蓝色和蓝色的稳定性。在室温时一般须放置1 h后比色，完全显色需要2~3 h。生成的蓝色很稳定，24 h内吸收值无显著变化。待测液中如有干扰的金属离子，可用EDTA等螯合剂掩蔽。

（1）试剂准备

①2 mol/L氯化钾（KCl）溶液  称取149.1 g KCl（分析纯），溶于水中，再稀释至1000 mL。

②酚溶液  称取10 g苯酚（C₆H₅OH）和100 mg硝基铁氰化钠[Na₂Fe(CN₅)NO·2H₂O]，溶于水中，再加水稀释至1000 mL。此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。硝基铁氰化钠有剧毒，使用时应注意。

③次氯酸钠（NaOCl）碱性溶液  称取10 g氢氧化钠（NaOH）、7.06 g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ .7H₂O)、31.8 g磷酸钠(Na₃PO₄·12H₂O)和10 mL次氯酸钠溶液，称取5.25 g次氯酸钠溶于100 mL水中即含5%有效氯的漂白粉溶液，溶于水中，再加水稀释至1000 mL。贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。

④掩蔽剂  称取40 g酒石酸钾钠（KNaC₄H4O₆·4H₂O）溶于100 mL水中。再称取10 g EDTA二钠盐溶于100 mL水中。然后将两种溶液按等体积混合，每100 mL混合溶液中加0.5 mL10 mol/L NaOH溶液。

⑤50 mg/L NH₄⁺-N标准溶液  称取0.236 g干燥的硫酸铵 (NH₄)₂SO₄溶于水中，再加水稀释至1000 mL。使用前再稀释成5 mg/L工作标准溶液。

（2）操作步骤

①待测液的制备  称取1.00 g新鲜土样置于10 mL离心管中，加入5 mL KCl溶液，密封，放在振荡机上水平振荡（180 r/min）1 h。静置，土样悬浮液澄清后，吸取上层清液进行分析。如不能在2 h内分析，用干滤纸过滤，滤液用5 mL离心管承接，置于冰箱中冷藏。如不能在24 h内测定，可冷冻于冰箱长期保存。浸提需要同时做空白试验。

②比色测定  吸取含NH₄⁺-N 0.5~2.5 µg滤液置于10 mL离心管中，用KCl溶液补充至5 mL。然后加入2.5 mL苯酚溶液和2.5 mL NaOCl碱性溶液，摇匀，在20℃室温下放置1 h后，加1 mL掩蔽剂以溶解可能产生的沉淀物，再用水稀释至刻度，摇匀。在分光光度计上于650 nm波长处测定吸光度，从标准曲线上查得相应的NH₄⁺-N浓度。

③标准曲线制备  分别取相当于0 µg、0.25 µg、0.5 µg、1 µg、2 µg、2.5 µg NH₄⁺-N标准溶液置于10 mL离心管中，各加入KCl溶液补至5 mL，按操作步骤操作，绘制工作曲线。各标准液的NH₄⁺-N浓度相应为0 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L。

注：掩蔽剂在显色后加入为宜。过早加入会使显色反应很慢，蓝色偏弱。加入过晚，则生成的氢氧化物沉淀可能老化而不易溶解。在20℃左右放置1 h后即可加入掩蔽剂。

（3）结果计算

  根据标准曲线计算待测液的铵态氮的含量，按下式进行计算:

NH₄⁺-N (mg· kg^-1) = ρ × V × ts / W

式中，ρ为从标准曲线上查得待测液的NH₄⁺-N浓度（mg/L）；V为显色液的体积（11 mL）；ts为分取倍数（浸提液总体积5 mL / 吸取浸提液）；W为换算后的烘干土样质量（g）。

5.4 土壤硝态氮（NO₃^--N）的测定

    利用酚二磺酸比色法测定土壤NO₃^--N含量。

（1）试剂准备

①1 mol/L HCl溶液  加入500 mL超纯水到1 L体积的容量瓶中，加84 mL浓HCl到容量瓶中，旋转容量瓶使之混合，用超纯水定容到1 L。

②饱和氯化钒（VCl₃）溶液  加入0.35 g VCl₃至50 mL的1 mol/L 的HCl中，若有必要可以过滤。注意：VCl₃易与空气反应，动作要快。

③20 g/L磺胺溶液  0.2 g磺胺溶解于10 mL的1 mol/L HCl溶液。

④2 g/L NED溶液。0.02 g盐酸萘乙二胺溶解于10 mL水中。

⑤反应液  50 mL饱和VCl₃溶液，3.3 mL 20 g/L磺胺溶液，3.3 mL 2 g/L NED溶液，400 mL去离子水，混合而成。

⑥50 mg/L KNO₃标准溶液  称取0.3609 g干燥的KNO₃溶于水中，再加水稀释至1000 mL。使用前再稀释成5 mg/L KNO₃的标准溶液。

（2）操作步骤

①待测液的制备  与土壤NH₄⁺-N的测定的浸提方式相同，获得过滤液。

②比色测定  吸取含NO₃^--N 0.5~2.5 µg滤液加入10 mL离心管中，用KCl溶液补充至5 mL。然后加入5 mL反应溶液，摇匀，在20℃室温下反应5 h或过夜，在分光光度计上于540 nm波长处测定吸光度，从标准曲线上查得相应的NO₃^--N的浓度。

③标准曲线制备  分别取相当于0 µg、0.25 µg、0.5 µg、1 µg、2 µg、2.5 µg NO₃^--N标准溶液置于10 mL离心管中，各加入KCl溶液补至5 mL，按操作步骤操作，绘制工作曲线。各标准液的NO₃^--N浓度相应为0 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L。

（3）结果计算

根据标准曲线计算待测液的硝态氮浓度，可按下式进行计算：

NO₃^--N (mg·kg^-1) = ρ × V × ts / W

式中，ρ为从标准曲线上查得NO₃^--N的浓度（mg/L）；V为显色液的体积（10 mL）；ts为分取倍数（浸提液总体积5 mL / 吸取浸提液）；W为换算后的烘干土样质量（g）。

5.5 土壤总磷（TP）的测定

总磷（TP）含量通过钼蓝比色法测定。用H₂SO₄-HClO₄提取总磷，提取液与钼蓝反应，在紫外分光光度计下测定。HClO₄既是一种强酸，又是一种强氧化剂，能氧化有机质，分解矿物质，而且HClO₄的脱水作用很强，有助于胶状硅的脱水，并能与Fe³⁺络合，比色测定中抑制了硅和铁的干扰。H₂SO₄的存在提高消化液的温度，同时防止消化过程中溶液蒸干，以利消化作用的顺利进行。

（1）试剂准备

①浓H₂SO₄。

②高氯酸（HClO₄）。

③2，6 -二硝基酚或2，4 -二硝基酚指示剂溶液  溶解二硝基酚0.25 g于100 mL水中。此指示剂的变色点约为pH 3，酸性时无色，碱性时呈黄色。

④4 mol/L NaOH溶液  溶解NaOH 16 g于100 mL水中。

⑤2 mol/L（1/2 H₂SO₄）溶液  吸取6 mL浓H₂SO₄，缓缓加入80 mL水中，边加边搅动，冷却后加水至100 mL。

⑥钼锑抗试剂  A溶液：5 g/L酒石酸氧锑钾溶液，取0.5 g酒石酸氧锑钾[K(SbO)C₄H₄O₆]，溶解于100 mL水中。B溶液：钼酸铵-H₂SO₄溶液，称取10 g钼酸铵[(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O]，溶于450 mL水中，缓慢地加入153 mL浓H₂SO₄，边加边搅。再将上述A溶液加入至B溶液中，最后加水定容至1L。充分摇匀，贮于棕色瓶中，此为钼锑混合液。当天临用前，称取左旋抗坏血酸（C₆H₈O₅，化学纯）1.5 g，溶于100 mL钼锑混合液中，混匀，此即钼锑抗试剂。有效期24 h，如藏冰箱中则有效期较长。此试剂中H₂SO₄为5.5 mol/L（H⁺），钼酸铵为10 g/L，酒石酸氧锑钾为0.5 g/L，抗坏血酸为1.5 g/L。

⑦50 mg/L 磷标准溶液  准确称取在105℃烘箱中烘干的KH₂PO₄（分析纯）0.2195 g，溶解在400 mL水中，加浓H₂SO₄ 5 mL，转入1 L容量瓶中，加水定容至刻度，此溶液不宜久存。使用前稀释至5 mg/L磷标准溶液。

（2）操作步骤

①待测液的制备  准确称取通过100目筛子的风干土样0.5000~1.0000 g，置于50 mL开氏瓶（或100 mL消化管）中，以少量水湿润后，加8 mL浓H₂SO₄，摇匀后，再加10滴HClO₄溶液，摇匀，瓶口上加一个小漏斗，置于电沪上加热消煮，至溶液开始转白后继续消煮20 min。全部消煮时间为40~60 min。在样品分解的同时做一个空白实验，即所用试剂同上，但不加土样，同样消煮得到空白消煮液。

将冷却后的消煮液转移至100 mL容量瓶中（容量瓶中事先盛水30~40 mL），用水冲洗开氏瓶（用水应根据少量多次的原则），轻轻摇动容量瓶，待完全冷却后，加水定容至100 mL。静置，待固形物完全沉淀后，小心地吸取上清液进行磷的测定。或者用干的无磷定量滤纸过滤，将滤液接收在100 mL干燥的三角瓶中待测定。

②比色测定  吸取澄清液或滤液5 mL注入50 mL容量瓶中，用水稀至30 mL，加2滴二硝基酚指示剂，滴加4 mol/L NaOH溶液直至溶液变为黄色，再加2 mol/L（1/2 H₂SO₄）溶液1滴，使溶液的黄色刚刚褪去。然后加钼锑抗试剂5 mL，再加水定容50 mL，摇匀。30 min后，用880 nm或700 nm波长通过酶标仪进行比色测定。

③标准曲线制备  准确吸取5 mg/L磷标准溶液0 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL。分别放入50 mL容量瓶中，加水至约30 mL，按操作测定。各比色液P的浓度分别为0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L。

（3）结果计算

根据标准曲线计算待测液的磷浓度后，可按下式进行计算：

P (mg·kg^-1) = ρ × V × ts / W

式中，ρ为待测液中磷的质量浓度（mg L^-1）；V为显色液的体积（50 mL）；Ts为分取倍数（过滤液的总体积 / 吸取用于比色的滤液体积）；W为烘干土质量（g）。

5.6 土壤金属离子的测定

            土壤金属离子包括钙、镁、钾、锰、铝等。金属离子含量是通过电感耦合等离子原子发射光谱仪测定。具体步骤如下：

（1）对土壤样品采用消解法进行预处理。首先，烘干土壤样品，之后用少量离子水对样品进行湿润处理，在湿润的土壤中加入硝酸、高氯酸或者氢氟酸等不同类型的单种酸或者组合酸，将混合有酸溶液的样品置于电热板上进行加热处理，重复两次至样品呈现灰色（白色），最后加入100 g/L硝酸溶液完成预处理。

（2）通过电感耦合等离子原子发射光谱仪（iCAP 6300, Thermo Jarrell Ash Co. USA）测定土壤金属离子浓度，不同类型的原子，在光源的照射下（通常是激发光源）会产生不同性质的辐射，辐射性质与原子的浓度相关，通过测定辐射性质来计算土壤金属离子浓度（高铭泽, 2019）。该方法具有较高的精确度，能大大提高土壤金属离子检测的速率和效果。

6 土壤微生物的分离鉴定方法

土壤微生物的分离培养对于土壤微生物多样性监测至关重要，虽然现代分子生物学技术为我们揭示了前所未见的微生物多样性，但单纯运用组学或宏组学方法对土壤的特异微生物群体进行生理代谢分析或下游开发应用还存在很大的难度，分离培养技术能够获得纯菌株，这些纯菌株一方面可验证土壤微生物多样性，另一方面可以用来验证分子生物学推测得到的信息及进行下游应用研究。

6.1 传统分离培养

传统分离培养法是在实验室内利用适合微生物生长的培养基进行分离微生物的方法。根据微生物种类不同，分离所用的培养基不同，一般情况下，使用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基分离土壤真菌，使用胰酪大豆胨液体培养基（TSB）分离土壤细菌。

6.1.1土壤真菌分离培养及鉴定

（1）配制PDA培养基  称取46 g PDA培养基粉，加入1 L去离子水，摇匀，使培养基粉分散，不要有团块；用灭菌专用封口膜将瓶口扎住，121℃灭菌15 min。灭好菌的培养基在室温下可放置一周。

（2）分离前准备工作 对超净工作台灭菌，一般紫外灯下灭菌20 min。向灭菌后的PDA培养基（待冷却至60~70℃）中加入氨基青霉素或链霉素等抗生素，防止细菌生长，注意抗生素溶液不可加热灭菌，不可紫外灭菌。然后准备倒平板。

（3）制备样品稀释液  称取5 g土壤，加水至45 mL，振荡20 min以使菌体分散，制成10^-1稀释度的土壤溶液；吸取5 mL 10^-1稀释度的土壤溶液，加水至45 mL，涡旋混匀，制备10^-2稀释度的土壤溶液；以此类推，继续制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度的土壤溶液。

（4）涂布  在平板底部边缘用记号笔写上培养基类型、稀释度、样品编号、实验者姓名和日期。用无菌移液枪分别吸取一定稀释度（通过预实验确定合适的稀释梯度）的土壤溶液100 μL放入相应的平板中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，将培养基在超净工作台中吹干3 min左右后，盖上皿盖。

（5）培养  涂布工作完成后，用封口膜缠绕培养基边缘一圈，然后将培养基倒置于28℃恒温箱中培养。

（6）挑菌  培养24 h后检查培养基，若看到有菌落长出，则用无菌牙签挑取少量菌落，转接到新的培养皿中；在培养皿的底部写上该菌落的编号；将培养基倒置于28℃恒温箱中培养；待菌落长成后，检查菌落是否单纯。若不单纯，可重复此步骤。

（7）提取菌株DNA 准备提取菌株DNA的离心管，每个样品准备两个，离心管A加入0.5 mL裂解液（1 mol/L KCl溶液，100 mmol/L Tris-HCl溶液，10 mmol/L EDTA溶液），离心管B加入0.3 mL异丙醇；在超净工作台上，挑取20~40 mm²菌落至离心管A中，用玻璃研磨棒轻缓地将菌丝推到离心管底部，打开电源，研磨2 s左右，以破坏细胞，释放DNA；将细胞裂解液5000 r/min离心10 min，把上清液转移至含0.3 mL异丙醇的离心管B中，避免吸入沉淀，弃去离心管A；上下颠倒离心管B以混匀溶液，12000 r/min离心10 min，用移液枪移除上清液，移除的越彻底越好；向离心管B中加入0.8 mL 70%乙醇，上下颠倒洗涤，12000 r/min离心10 min，用移液枪移除上清液，重复该步骤一次；然后使用真空干燥机干燥DNA；样品干燥好后，加入50 μL去离子水或1×TE缓冲液，用移液枪轻轻吸打以溶解DNA。

（8）PCR扩增和鉴定  使用2.2.2方法扩增菌株ITS2区，并进行测序鉴定。

6.1.2土壤细菌分离培养及鉴定

（1）配置TSB培养基  胰酪胨17.0 g，氯化钠5.0 g，大豆木瓜蛋白酶消化物3.0 g，磷酸氢二钾2.5 g，葡萄糖（一水合/无水）2.5 g，琼脂20.0 g，pH 7.3±0.2。

（2）   细菌分离、提取DNA方法参见6.1.1。

（3）PCR扩增和鉴定  PCR扩增使用515F/806R引物对扩增细菌V3-V4区，其他方法参见2.2.2。

6.2 原位培养

传统分离培养法很难满足大多数微生物生长需求，原因可能为：①培养基营养基质难以模拟真实生长环境，如某些关键化学成分缺失、浓度过高等；②原有共生关系破坏，土壤微生物相互之间的作用、代谢产物交流等影响微生物生长的条件几乎不可能在纯培养条件下实现；③培养条件无法模拟真实环境，如温度、湿度等；④生长缓慢的微生物被忽视等。基于以上问题，研究人员找到了一些微生物培养新技术，如原位培养。

原位培养是通过选择透性滤膜直接进行天然环境原位培养微生物的方法。该方法最初是由Epstein和Lewis团队在2002年设计的一种“扩散盒”用于培养海洋潮汐带沉积物中的微生物。后来“扩散盒”被改进用来选择性分离放线菌和丝状真菌。该装置的结构可参考张作艳等（2018）的描述，主要的组成是半透膜，半透膜的孔径要依据分离的微生物类群决定，如半透膜孔径为0.2 ~ 0.6 μm，适用于放线菌和丝状真菌的培养，如果将半透膜孔径缩小到只有0.2 μm，则只有丝状真菌才能够进入生长盒。